TOPO-Blunt Simple Lightning Cloning Kit-
可在室溫條件下，20分鐘完成TA克隆或Blunt克隆，陽性率接近100%，并且免冰浴、免熱激、免藍白斑篩選，還可以連接長達10kb的DNA片段。TOPO-Blunt Simple Lightning Cloning Kit-
TOPO-Blunt Simple Lightning Cloning Kit
TOPO-Blunt Simple Lightning Cloning Kit-
目錄號：42117
產(chǎn)品內(nèi)容：
產(chǎn)品成份 | 42117-20 (20 rxn) | 42117-80（80 rxn） |
pTOPO-TA/Blunt Vector(30ng/ul) | 20 ul | 80 ul |
1000bp Control (30ng/ul) | 5 ul | 5 ul |
10x Enhancer | 20 ul | 80 ul |
保存條件：
-20℃，存放 12 個月，不影響使用效果。
產(chǎn)品簡介：
可在室溫條件下，20分鐘完成TA克隆或Blunt克隆，陽性率接近100%，并且免冰浴、免熱激、免藍白斑篩選，還可以連接長達10kb的DNA片段。
克隆步驟（≤3kb 片段）： 簡化步驟（≤10kb 片段）-- 免復蘇，免液體 LB
1、連接：室溫 5 分鐘； 1、連接: 37℃連接 5 min。
2、轉(zhuǎn)化：室溫 5 分鐘； 2、轉(zhuǎn)化：冰浴 5 min，42℃熱激 1 min，冰上 2 min。
3、復蘇：180rpm、37℃振蕩培養(yǎng) 10 分鐘；涂板。 3、取全部菌液涂板，37℃倒置培養(yǎng)。
操作步驟：
1. PCR 產(chǎn)物的制備：
a. 引物要求：引物不能磷酸化。
b. 酶的選擇：根據(jù)需要選擇DNA 聚合酶，該載體兼容PCR 產(chǎn)物的A 末端和平末端。
c. 電泳檢測 PCR 產(chǎn)物的量和質(zhì)量：
①僅有目的條帶，可直接進行連接反應，無需純化；
②如果有多條帶，建議凝膠回收 DNA 片段（DC011-100）;
③如果以質(zhì)粒為模板的擴增，則必須進行凝膠回收，因為模板質(zhì)粒也會長出非目的菌落。
2. 連接反應：
1）室溫（20℃-37℃）建立連接體系（10ul 體系）：
純化后的 PCR 產(chǎn)物 | 0.5-8ul |
pTOPO-TA/blunt Vector | 1ul |
10 ? Enhancer | 1 ul |
滅菌水 | X ul |
總體積 | 10 ul |
不同大小插入片段的推薦用量：
插入片段大?。╞p） | 最佳用量（ng） |
100-1000 | 10-40 |
1000-2000 | 40-80 |
2000-5000 | 80-150 |
加完試劑后，輕彈管底混勻（或輕輕吹打混勻），點甩離心收集所有液體在離心管底。
2) 室溫（20℃-37℃）連接 5 分鐘。連接產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，或置于冰上備用。
3. 轉(zhuǎn)化、復蘇、涂板：
1）100ul 感受態(tài)細胞，置于室溫解凍（約 1 分鐘左右），輕撣幾次將細胞均勻懸浮。
2） 加入 10ul 連接液，輕輕混勻，室溫（20℃-37℃）放置 5 分鐘。
3） 加入 500ul 平衡至室溫的 LB 或者 SOC 培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃ 180 rpm 振蕩培養(yǎng) 10 min。
（注意：大于 3kb 的片段，振蕩培養(yǎng)時間延長至 30-60 分鐘，可以增加轉(zhuǎn)化子。或者用簡化步驟）
4） 取 200?l 菌液涂板(含氨芐青霉su 50-100ug/ml），培養(yǎng)過夜。（為得到較多克隆，4000 rpm 離心 1 min，吸棄掉部分上清，保留 100-150ul，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板）
注意：如果使用 5ul 體系，各成分按照比例減半，使用次數(shù)可以加倍。
4. 轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定：
本制品陽性率相當高，一般情況下，可以達到所見即所得，只要是長出來的菌落正常（不是污染的雜菌，轉(zhuǎn)化子數(shù)量也不算太少），基本就包含插入。因此插入片段不超過 2-3kb 的情況下可以不用鑒定直接挑 1-2 個菌去測序。
1） 菌落 PCR 檢測：挑單菌落于 10ul 無菌水中，混勻，取 1ul 置于 25ul PCR 體系,用 PCR 引物或者M13 通用引物去鑒定陽性克隆。
2）用通用 M13F（-20）/M13R（-26）引物測序來確定是否含有目的克隆。
